בקבוקון אחד, שתי מטרות: אבחון שחפת נייד מבוסס CRISPR עם רגישות של 100%

מאמר על בדיקת שחפת ניידת שניתן לבצע ישירות מליחה, ללא ציוד מורכב, פורסם ב- Science Advances. הגברת DNA איזותרמית וקריאת CRISPR משולבות במבחנה אחת; שתי הוספות שמרניות של M. tuberculosis (IS6110 ו-IS1081) נבדקות בו זמנית, בתוספת גן אנושי כביקורת דגימה פנימית. במבחן "עיוור" קטן על דגימות קליניות, הבדיקה נתנה רגישות של 100% (6/6) וספציפיות של 100% (7/7) בהשוואה לתרבית; גבול הגילוי הוא ~69-81 CFU/ml בליחה מדומה. ניתן לראות את התוצאה על רצועת בדיקה מנייר, והריאגנטים עוברים ליופיליזציה (אחסון ללא "שרשרת קרה").

רֶקַע

על פי ארגון הבריאות העולמי, שחפת תהרוג כ-1.25 מיליון בני אדם בשנת 2023; שחפת הפכה שוב לגורם המוות הזיהומי המוביל, עם כ-10.8 מיליון מקרים. עובדה זו הופכת את האבחון הנגיש והמהיר לחיוני, במיוחד בסביבות מוגבלות במשאבים.

• הבדיקות הנוכחיות הן פשרה בין דיוק, מהירות ומחיר. תרבית "סטנדרט הזהב" מדויקת מאוד אך איטית; מיקרוסקופיה מהירה אך לא רגישה; פלטפורמות PCR כמו Xpert MTB/RIF Ultra רגישות משמעותית יותר (LOD ≈ 15.6 CFU/ml), אך דורשות ציוד ומחסניות יקרות, מה שמגביל את הכיסוי.
• למה איזותרמי ו-CRISPR? הגברה איזותרמית של RPA פועלת בטמפרטורה של 37-42 מעלות צלזיוס ואינה דורשת ציקלרים תרמיים - נוח "בשטח". קריאת CRISPR (Cas12/13) מוסיפה ספציפיות למין ומאפשרת זרימה רוחבית חזותית ("פס") ללא אופטיקה מורכבת. בסך הכל, זוהי הדרך לבדיקות PVR ניידות וזולות.
• מדוע שתי מטרות MBT בו זמנית (IS6110 + IS1081). IS6110 הוא תוספת מרובה עותקים של קומפלקס M. tuberculosis, אך לחלק מהקווים יש מעט עותקים, ובדיקות עבור IS6110 בלבד עלולות "להחמיץ". הוספת תוספת IS1081 שנייה מפחיתה את הסיכון לתוצאות שליליות שגויות.
• מדוע בקרה אנושית פנימית. דגימות נשיפה יכולות להכיל מעכבים ודגימות "רעות". בקרה אנושית אנדוגנית (למשל RNase P/DNA גנומי) מאשרת שהחומר מספק והתגובה אינה מדוכאת - אחרת לא ניתן להתייחס לתוצאה שלילית.
• פורמט ה-one-pot חשוב כשלעצמו. הוא מפחית שלבים, מפחית את הסיכון לזיהום ומקל על עבודה מחוץ למעבדה. גישות כאלה לשחפת כבר הראו ישימות; העבודה החדשה מרחיבה את הרעיון לפורמט כפול מטרה עם בקרות פנימיות, בנוסף מדגימה ליופיליזציה של ריאגנטים וקורא רצועות.
• מה הערך של המאמר הנוכחי? המחברים הדגימו זיהוי ישירות מליחה לאחר הכנת הדגימה הפשוטה ביותר, גבול הזיהוי של ~70-80 CFU/ml בליחה מדומה, ורגישות/ספציפיות של 100% על קבוצה קטנה וסמיות של דגימות קליניות - "הדגמה טכנולוגית" טובה לאימותים רב-מרכזיים נוספים.

איך זה עובד

• המדענים שילבו RPA (הגברה איזותרמית מהירה של חומר גנטי ב-37 מעלות צלזיוס) עם האנזימים "החיתוך" Cas13a/Cas12a. לאחר שבחרו את ה-RNA המנחה, הם הגדירו את המערכת כך שתתמקד בשתי מטרות MBT בו זמנית, ובמקביל ל-DNA אנושי (ובכך בדקו שיש חומר בדגימה והתגובה לא "נתקעה").
• כל הכימיה נכנסת למבחנה אחת; לאחר הדגירה, התוצאה נקראת באמצעות פלואורימטר או על גבי רצועת זרימה צידית - בעצם כמו בדיקה אקספרס.
• עיבוד כיח פושט לחימום וצנטריפוגה קצרה - ללא מחלצי חומצות גרעין. עבור התנאים המוגבלים ביותר, המחברים אף דנים בחלופות ידניות לצנטריפוגה.

מה הראו הבדיקות

• גבול גילוי: 69.0 CFU/ml (זן H37Rv) ו-80.5 CFU/ml (BCG) בכיח "ספייק". לא זוהתה תגובה צולבת עם חיידקים/פטריות אחרים.
• סביבה קלינית (דגימות עיוורות): על 13 דגימות מניסוי אמיתי - רגישות של 100% (6/6) וספציפיות של 100% (7/7) יחסית לזריעה. לשם השוואה, באותה ערכה, GeneXpert Ultra הראה 100%/86%, בהתאמה.
• ניואנסים טכניים: מבין שתי אפשרויות הקריאה, Cas13a עבד טוב יותר (עבור פורמט "סיר אחד", הוא רגיש יותר מ-Cas12a). בנוסף, בדיקה מקבילה של שתי מטרות Mtb מפחיתה את הסיכון לתוצאות שגויות.

למה זה הכרחי?

הבדיקות של היום הן פשרה בין דיוק, מהירות וזמינות: תרבית מדויקת מאוד אך איטית; מטושים מהירים אך לא מדויקים; מערכות PCR כמו GeneXpert מדויקות ומהירות אך דורשות מכשירים ומחסניות יקרות. גישת CRISPR החדשה שואפת לסגור את הפער: אבחון שדה הפועל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם קריאות רצועות נייר, ופוטנציאל לאחסן ריאגנטים ללא קירור.

מגבלות ומה הלאה

זוהי הדגמה מוקדמת על מערך קליני קטן - יש צורך בבדיקות גדולות ורב-מרכזיות (כולל זיהום משותף של HIV, אצל ילדים, עם צורות פאוסיביצילריות וקווי MBT שונים). המחברים מציינים בנפרד כי בגרסת ה"שטח" עצמה, יהיה צורך להחליף את הצנטריפוגה השולחנית בתמיסה ידנית לחלוטין. אך הארכיטקטורה עצמה - "שתי מטרות + בקרה פנימית" במבחנה אחת - כבר הוכיחה את יכולת הפעולה שלה ומספקת דרך ברורה לעידון לשימוש המוני.

מקור: אלכסנדרה ג'י בל ואחרים. בדיקה יעילה מבוססת CRISPR לגילוי שחפת ישירות מהכיח, Science Advances, פורסם באינטרנט ב-6 באוגוסט 2025 (כרך 11, גיליון 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206